Zloženie, príprava, konzervácia, uskladnenie a uzatváranie nealkoholických nápojov s obsahom metabolitov a ich konzervácie

O Výskume

Proces výroby sladkých nealkoholických nápojov sa vo všeobecnosti v posledných dekádach zameral na prídavok HFCS- 55 ( z angl. high-fructose corn syrup). Tento druh sladidla v porovnaní s prírodnou sacharózou obsahuje o 5% viac fruktózy, čo sa odzrkadľuje na silnejších prejavoch sladkej chuti nealkoholických nápojov. Aj takáto malá zmena v percentuálnom zastúpení fruktózy však zvyšuje riziko vzniku metabolických porúch smerujúcich k nárastu hmotnosti (Mock  a kol., 2017).

Náš výskum sa preto zameriava na produkciu nápojov, ktoré spolu s prídavkom ovocných štiav budú vhodnou alternatívou za intenzívne sladené komerčné nápoje. Hlavnými vstupnými surovinami na výrobu týchto nápojov je voda, slad, chmeľ, ovocné šťavy a v prípade fermentovaných variant aj rôzne druhy kvasničných kmeňov. V prvých krokoch výskumu boli uskutočnené experimenty na vytvorenie cukorného roztoku s najvhodnejšou koncentráciou cukrov. Následne bola táto sladina zaočkovaná kvaničnou zmesou kmeňa nesacharomycétnej kvasinky  a sacharomycétnej kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Táto kvasničná zmes bola zvolená na základe publikácie Canonico a kol. (2015), vďaka ktorej bola dosiahnutá znížená produkcia etanolu. V našom výskume boli uskutočnené kofermentácie s modifikáciou fyzikálnych parametrov (teplota, pH) a prídavkami organických kyselín (kyselina citrónová, kyselina mliečna).

V prvých etapách boli vykonané fermentácie s modifikáciou počiatočnej teploty kvasenia . Odbery vzoriek boli uskutočňované v 16, 40, 64 a 168  hodine od začiatku kultivácie. Počiatočná teplota kultivácie bola 18°C. V 40 hodine bolo uskutočnené schladenie fermentačného tanku na 3°C pričom bola ukončená po 168 hodinách Výsledky sú zobrazené v tabuľke č.1. V 64 hodine boli do kvasného tanku pridaný granulát rastliny Humulus lupulus.

Tab.č.1.: Priebeh fermentácie s modifikáciou fermentačnej teploty

Množstvo etanolu bolo stanovené HPLC metódou. Na základe výsledkov sme sledovali, že znížením teploty počas fermentácie došlo k spomaleniu tvorby etanolu. Medzi 64 a 168 hodinou došlo k zvýšeniu koncentrácie etanolu. Následne bol analyzovaný  možný dôvod tohto zvýšenia. Podľa publikácie Kirkpatrick a Shellhammer (2018) rastlina Humulus lupulus obsahuje amyloglukozidázy, alfa-amylázu, beta-amylázu a dextrinázu. Tento fakt mal za následok dodatočné štiepenie neutilizovateľných polysacharidov na sacharidy jednoduchšie. To spôsobilo zvýšenie koncentrácie substrátu potrebného pre metabolizmus kvasníc v anaeróbnych podmienkach, čo následne spôsobilo navýšenie koncentrácie etanolu.

Obr.č.1: zníženie hustoty extraktu po prídavku chmeľu a kvasníc do pasterizovaného piva (+Hops/+Yeast) (Kirkpatrick a Shellhammer, 2018).

Toto zistenie výrazne prispeje ku schopnosti regulácie procesu so zámerom tvorby nízkej koncentrácie etanolu.

Výstupy z týchto experimentov boli aplikované do ďalšieho kroku výskumu, v ktorom bolo sledované ako prídavok organickej kyseliny ovplyvní metabolizmus kvasinky S.cerevisiae. Do sladiny s rovnakou hustotou extraktu bola pridaná organická kyselina o výslednej koncentrácií 0,2 g/l. Podmienky kultivácie boli rovnaké ako v predchádzajúcom experimente. Po 14 dňoch kultivácie bolo uskutočnené stanovenie glycerolu a etanolu. Výsledná koncentrácia etanolu bola 8,7 g/l. Táto koncentrácia bola vyššia ako v prvom prípade, čo bolo pravdepodobne spôsobené dlhšou fermentáciou. Dôležitým výstupom z tohto experimentu je avšak to, že došlo k zvýšenej tvorbe glycerolu v porovnaní s bežnými alkoholickými pivami. Pomer vzniknutých látok etanol:glycerol bol v našom prípade 14,3:1. V prípade referenčnej vzorky bol tento pomer vyšší a to 21,6:1.  To naznačuje, že prídavok kyseliny citrónovej spôsobuje zvýšenie produkcie glycerolu voči etanolu. Dôvod tohto výsledku je spojený pravdepodobne s tým, že glycerol vystupuje ako vedľajší produkt pri glykolýze (viď obr.č.2).

Obr.č.2.: Komplexná schéma metabolizmu glukózy (Geertman a kol.,2006).

Tab.č.2. : porovnanie koncentrácie etanolu a glycerolu pri bežnom alkoholickom pive (MDS) a pive s prídavkom kyseliny citrónovej pri zníženej teplote kultivácie a upraveným extraktom na začiatku kultivácie

Výsledné chromatografické záznamy sú zobrazené na obr.č. 3. (MDS) a obr.č.4. (nízkoalkoholický produkt). Ako je zrejmé zo záznamu č.4. daná kofermentácia dvomi druhmi kvasiniek spôsobila okrem zmeny vo výslednej koncetrácií etanolu a glycerolu aj zníženú schopnosť utilizovať maltózu (čas elúcie 7,262 a 7,248 min).

Obr.č.3.: chromatografický záznam vzorky alkoholického piva

Obr.č.4.: chromatografický záznam vzorky nízkoalkolického produktu

Následne sme pre ďalšie smerovanie výskumu uskutočnili fermentácie, ktoré nadväzujú na prvú časť experimentov, ktorých úlohou bolo dosiahnuť vhodné senzorické vlastnosti produktu  spolu so znížním objemového obsahu alkoholu pod 0,5%.

Keďže v predošlých fermentáciách bolo prekročených 0,5% ABV, bolo potrebné ďalej optimalizovať chemické a fyzikálne parametre fermentácie. V kultivácií TR3 sme znížili zákvasnú teplotu a počiatočnú hustotu mladiny. Znížením teploty sme spôsobili spomalenie rastu kultúry a predĺženie lag fázy rastovej krivky a v kombinácií so znížením počiatočnej hustoty mladiny sme dosiahli takmer 50% zníženie ABV. Spolu so znížením koncentrácie etanolu došlo aj k zníženej tvorbe glycerolu v podobnej intenzite. Na obr. 5 je zobrazený priebeh kultivácie, ktorý znázorňuje aktuálne koncentrácie jednotlivých sacharidov, etanolu a glycerolu. Glukóza spolu s fruktózou nie je v mladine výrazne zastúpený sacharid a ich počiatočná koncentrácia závisí od počiatočnej hustoty mladiny a rmutovacej schémy varného procesu. Transport glukózy je uskutočňovaný uľahčenou difúziou. Spolu s priamym vstupom do procesu glykolýzy predstavuje tento cukor pre kvasinku rýchly  a ľahko utilizovateľný zdroj uhlíka. Práve počiatočná koncentrácia glukózy zohráva dôležitú úlohu v znížení tvorby etanolu.

Obr. č.5.: graf kultivácie TR3 znázorňujúci koncetrácie jednotlivých sacharidov (g/l) mladiny, glycerolu (g/l) a etanolu (g/l) v čase.

Utilizácia maltózy mala slabšiu intenzitu. Transport maltózy je uskutočňovaný aktívnym transportom protónovými symportérmi a tým vyžaduje spotrebu energie a aktiváciu plazmatickej ATP-ázy  (Serrano, 1997). Mechanizmy transportu cez membránu sú zobrazené na obr. č.6.

Obr.č.6.: Jednotlivé mechanizmy transportu pre jednotlivé metabolity (Bisson a kol., 2016).

Zo senzorického hľadiska je pri nealkoholických chmeľových nápojoch problematická nízka plnosť produktu, ktorá súvisí s nízkou hustotou mladiny. Preto sme pri ďalšej fermentácií ozn. TR4 zvýšili pôvodný extrakt o 0,3 P°. Pre zamedzenie prekročenia 0,5% ABV sme skrátili čas fermentácie prebiehajúcej pri 13 °C o 24 h. Výsledky fermentácie TR4 sú zobrazené na obr. č.4.

Obr. č.7.: graf kultivácie TR4 znázorňujúci koncetrácie jednotlivých sacharidov (g/l) mladiny, glycerolu (g/l) a etanolu (g/l)  v čase.

V prípade fermentácie TR4 došlo zvýšením celkového extraktu najmä k navýšeniu počiatočnej koncentrácie maltózy s takmer nezmenenou počiatočnou koncentráciou glukózy. Tento fakt súvisí a potvrdzuje vhodne zvolenú rmutovaciu schému smerujúcu k nízkej koncentrácií glukózy. Zvýšenie ABV súvisí nie len so zvýšením počiatočnej hustoty mladiny, ale aj s postupným znižovaním teplôt. V prípade kultivácie TR4 bolo uskutočnené zníženie teploty z 13 °C na 8 °C nie priamo na 2 °C ako v prípade kultivácie TR3. Následne sme výsledky z kultivácií TR3 a TR4 aplikovali v ďalšej kultivácií ozn. TR5. V tejto kultivácií sme znížili kvasnú dávku oboch kmeňov kvasníc o 40 %.  Zníženie dávky kvasníc spôsobilo miernejší úbytok glukózy. V kultivácií TR5 sme stanovovali aj koncentráciu fruktózy. Napriek zvýšeniu počiatočnej hustoty mladiny sme dosiahli zatiaľ najnižšiu koncentráciu etanolu na konci fermentácie. Krok zníženia počiatočnej kvasnej dávky preto považujeme za kľúčový. Priebeh kultivácie je zobrazený na obr.č.8.. Zaujímavý je fakt, že pomer vzniknutého glycerolu ku etanolu je takmer totožný ako v prvých experimentoch a to 1:14,06.

Obr. č. 8.: graf kultivácie TR5 znázorňujúci koncetrácie jednotlivých sacharidov (g/l) mladiny, glycerolu (g/l) a etanolu (g/l)  v čase.

Pri odbere č. 4. sme zaznamenali nárast  koncentrácie glukózy a fruktózy, ktorý opäť nastal po uskutočnení studeného chmelenia. Navýšenie koncentrácie týchto dvoch monosacharidov môže následne spôsobiť výraznejší nárast koncentrácie etanolu v neskorších fázach fermentácie.

V kultivácií TR6 sme znížili kvasnú dávku oproti kultivácií TR5 o 4%. Ďalej sme uskutočnili zmeny v rmutovacej schéme, ktorá spôsobila pokles počiatočnej koncentrácie glukózy o 25 % a pokles počiatočnej koncentrácie glukózy o 47% v porovnaní s kultiváciou TR5. Priebeh kultivácie TR6 je zobrazený na obr. č. 9.

Obr. č. 9.: graf kultivácie TR6 znázorňujúci koncetrácie jednotlivých sacharidov (g/l) mladiny, glycerolu (g/l) a etanolu (g/l)  v čase